Um importante recurso hídrico que abastece a região do Vale do Rio Pardo é o Rio Pardinho. Dados sobre a condição das águas mostram que a influência antrópica é determinante na sua qualidade. Os ambientes aquáticos podem sofrer alterações imperceptíveis por testes da qualidade da água. O dano pode estar em nível molecular e testes genotóxicos como o Ensaio Cometa (EC), que avalia lesões em nível de DNA, podem sugerir alterações ambientais causadas por agentes tóxicos. O presente trabalho objetivou avaliar o potencial genotóxico de quatro pontos amostrais no Rio Pardinho (P1, P2, P3 e P4) no inverno e primavera de 2013 e no verão de 2014, utilizando o EC com Astyanax fasciatus. Foram coletados, em média, 9 indivíduos por ponto e estação. Amostras de sangue foram obtidas por punção cardíaca e armazenadas ao abrigo da luz até a realização do EC. Foi utilizada a versão alcalina do EC adaptado de Groff et al., seguida da coloração com nitrato de prata e a análise em microscopia óptica (100X). Os nucleoides foram classificados em cinco classes de danos (0 sem dano à 4 dano máximo). Após, foram calculados a Frequência de Danos (FD) e o Índice de Danos (ID), sendo a análise estatística realizada no software GraphPad Prism 5.0, utilizando o teste de Kruskall-Wallis, seguido do pós-teste de Dunn. O P1 localiza-se próximo à nascente, enquanto P4 está próximo à foz do rio. O P1 está localizado distante dos centros urbanos, em zona rural caracterizada por poucas propriedades com pequena atividade agropecuária. O P2 se localiza em área rural caracterizada por extensas lavouras de tabaco e milho ao seu entorno, o que sugere a possibilidade de que agroquímicos possam ser lixiviados para o leito do rio, sendo esse o principal fator impactante a ser considerado nesta área. O P3 se encontra em área urbana e sofre grande influência dos arroios que cortam o município de Santa Cruz do Sul e que carreiam efluentes domésticos, urbanos e industriais para o rio antes do ponto de coleta. Já o P4 localiza-se em área rural após os centros urbanos de Santa Cruz do Sul e Vera Cruz, possui lavouras de arroz e pecuária ao seu entorno, sendo considerado pela FEPAM-RS área crítica de poluição ambiental. Os resultados do EC sugerem que o ID não aumenta gradativamente da nascente em direção à foz em todas as estações, pois na primavera o ID em P2 e P3 estavam significativamente aumentados em relação ao P1. O P1 apresentou os menores valores de ID e FD em todas as estações, podendo ser considerado como o grupo controle do experimento. No inverno, o P4 demonstrou maior potencial genotóxico, se diferenciando estatisticamente de P1 e P2. Já na primavera, somente P1 estava com potencial genotóxico baixo, se diferenciando estatisticamente de P2, P3 e P4. No verão, o potencial genotóxico do P2 voltou a diminuir, diferenciando-se estatisticamente de P4, que continuava elevado. As características dos pontos amostrados variaram de acordo com a urbanização e estação do ano, sugerindo que a variação do potencial genotóxico detectado pelo EC esteja associada ao uso de agrotóxicos, como ocorre na primavera, coincidindo com a época do plantio de mudas pelos agricultores. Portanto, seu uso intensivo seria uma explicação para o aumento considerável da genotoxicidade do P2 nesta estação. Assim, o EC com A. fasciatus demonstrou-se uma ótima ferramenta para o biomonitoramento ambiental, evidenciando alterações em locais utilizados pela população próxima para lazer e pesca, como é o caso do P2.