APLICAÇÃO DE FT-IR PARA PREDIÇÃO DE FREQUÊNCIA DE DANO E ÍNDICE DE DANO DE ENSAIO COMETA: UM MODELO COM AZADIRACTINA EM DANIO RERIO

Resumo

Na agricultura orgânica, biopesticidas como o óleo de Nenn, cujo princípio ativo é a azadiractina, são utilizados com frequência, suscitando a necessidade de aplicação de ensaios de genotoxicidade como o Ensaio Cometa (EC), que é oneroso dificultando sua implantação como rotina. A azadiractina atualmente é classificada como medianamente tóxica e pouco perigosa ao meio ambiente, porém ensaios de genotoxicidade avaliando os seus efeitos são raros. Neste contexto o objetivo deste trabalho consistiu em avaliar o potencial de aplicação da FT-IR, uma nova tecnologia, para prever os valores de Frequência de Dano (FD) e de Índice de Dano (ID) obtidos através do EC com Danio rerio, um peixe já usado como modelo para avaliação de substâncias químicas com em ensaios toxicológicos e de embriogênese. O teste de genotoxicidade foi baseado na norma da ABNT-NBR 15499 para toxicidade crônica de curta duração (7 dias) para peixes, os quais foram adquiridos comercialmente, todos da mesma linhagem e aclimatados durante três semanas (25±2°C, fotoperíodo de 12h e renovação de 1/3 de água a cada 48h). Cinco grupos de 15 animais foram expostos, nas mesmas condições, sendo controle negativo (CN), controle positivo (CP) e três concentrações de Azadiractina 6µg/mL; 3µg/mL; 1,5µg/mL retirando cinco exemplares de cada grupo em 24, 48 e 168h para o teste. Para a realização do EC, foi utilizada a versão alcalina adaptada de Singh et al. (1988). A coleta do sangue ocorreu, após dessensibilização por banho de gelo, através de corte único. O sangue foi transferido para meio RPMI (1:100) e 30 µL misturados a agarose low-melting e pipetados sob lâminas de microscopia pré-cobertas com agarose. As lâminas foram imersas em solução de lise para desenovelamento seguido de eletroforese (20 min, 300mA, 25v). Após neutralizadas, fixadas e coradas com Nitrato de Prata, as análises foram realizadas em 100 nucleoides por lâmina, totalizando 500 nucleoides, classificados em cinco classes de 0 a 4. Os resultados da FD e do ID foram analisados através do teste não-paramétrico Mann-Whitney com nível de significância de 5% comparando-se os grupos testes em relação ao CN. A análise por FT-IR foi realizada com o esfregaço de sangue de cada animal depositado em probe de 50mm², após desidratação (60-65ºC, 5 min) usando refletância total atenuada, 4000-650 cm^-1. Os espectros foram normalizados pela amplitude entre 0 e 1,0 e foram submetidos à análise multivariada através da regressão por mínimos quadrados parciais (PLS) com pré-processamento auto escalado, supervisionado por FD e ID. O conjunto de calibração foi definido segundo a norma ASTM E1655-05 e o conjunto de validação foi obtido com base na exclusão sistemática 2:1 do conjunto total de amostras ordenadas por valores crescentes de RMSECV. A análise multivariada obteve o menor RMSECV com 8 variáveis latentes e R² = 0,9997. O modelo de correlação para a o ID apresentou R= 0,9998; S= 2,0706; equação y= 0,9989 (±0,0032)x + 0,128 (±0,5828)*x e P < 0,0001. Para a FD o modelo de correlação apresentou R= 0,9998; S= 0,54; equação y= 1,0036 (±0,0030)x + 0,0733 (±0,1990)*x e P < 0,0001. Os resultados demonstram que através da FT-IR foi possível predizer os valores para a FD e ID em D. rerio através da análise de sangue por meio da correlação com o valor de referência. O método apresentou boa qualidade preditiva, podendo ser implementado como alternativa na determinação da FD e do ID em ensaio genotóxicos, quando esta informação não for conhecida.