UTILIZAÇÃO DA TÉCNICA DE QPCR PARA CONFIRMAÇÃO DA PRESENÇA OU AUSÊNCIA DE LEVEDURAS EM AMOSTRAS DE SECREÇÃO VAGINAL

Resumo

As leveduras do gênero Candida fazem parte da microbiota humana e animal, podendo colonizar a pele, mucosas oral e vaginal e serem isoladas no sangue. São consideradas o principal grupo de fungos patógenos oportunistas. Dentre as espécies mais prevalentes estão Candida albicans, C. parapsilosis, C. glabrata, C. tropicalis e C. krusei. As infecções fúngicas são cada vez mais frequentes, principalmente relacionadas ao sistema geniturinário e causadas por Candida spp. O diagnóstico fúngico geralmente ocorre através da cultura de fluídos corporais e tecidos, o que apresenta demora dos resultados e possível contaminação no cultivo ou na amostra. A identificação correta é crucial para determinar o agente patogênico, a escolha e duração da terapia escolhida. Neste sentido, objetivou-se desenvolver uma técnica de qPCR com SyberGreen para identificação da presença da levedura Candida em amostras de secreção vaginal. Estudo experimental e transversal, com amostras coletadas de todas as mulheres atendidas de março a dezembro de 2016 para exames rotineiros de amostras vaginais em um centro de atendimento a comunidade no interior do Rio Grande do Sul, independentemente de serem sintomáticas ou não. Então, extraiu-se o DNA de 18 amostras de secreção vaginal através de um protocolo baseado na utilização de Proteinase K e NaCl, destas 9 eram positivas e 9 negativas para crescimento de levedura em placa. As amostras e 4 cepas padrão de diferentes espécies de Candida (Candida parapsilosis, C. lusitaneae, C. tropicalis, C. glabrata) para posterior comparação foram submetidas a Reação em cadeia da polimerase em tempo real (qPCR) seguindo as diretrizes “Informações Mínimas para a Publicação de Experimentos de PCR Quantitativos em Tempo Real" (MIQE) e os resultados foram confirmados em eletroforese de gel de agarose 1,5 %. As amostras também foram cultivadas em ágar e analisadas através da técnica espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier (dados não apresentados). A curva de calibração com 4 pontos de diluição seriada apresentou eficiência de 80,7 %, variando do equivalente de DNA genômico de 25x105 a 25x102 UFC/mL. A sensibilidade e especificidade da qPCR frente ao teste de crescimento microbiológico foi de 67 %, e pode-se identificar 55,5 % das amostras a nível de espécie. Em relação as análises das amostras de secreção vaginal, do total de 9 amostras negativas para levedura, 100 % tiverem algum tipo de amplificação, o que demonstra a presença da levedura na microbiota normal, apenas uma das amostras negativas apresentou banda no gel, caracterizando uma contaminação ou uma quantidade grande da levedura na microbiota da paciente. Dentre as amostras positivas, pode-se inferir que 33 % são Candida albicans, 22 % C. tropicalis e em 44 % não foi possível a identificação. As análises quantitativas demonstraram a possibilidade de identificação da presença do equivalente de DNA de Candida sp. a partir de 205x103 UFC/mL. Assim, concluímos que a utilização da qPCR para confirmação da presença e ausência serve como método comparativo a outros, como o FT-IR e os testes microbiológicos usuais, a não ser que seja padronizada uma técnica de extração, primers ou coleta de amostras diferente e que garanta maior sensibilidade.