APLICAÇÃO DE CFDNA E FT-IR NA DISCRIMINAÇÃO DE PACIENTES HÍGIDOS E COM CÂNCER COLORRETAL UTILIZANDO PLS-DA

Resumo

O câncer é uma das doenças mais frequentes do século 21. Contudo, as técnicas utilizadas no seu diagnóstico não são suficientemente sensíveis para fazê-lo, sobretudo em estágios iniciais. O plasma contém informações sobre biomarcadores de diagnóstico e prognóstico para pacientes oncológicos, destacando-se o DNA livre de células (cfDNA). Métodos espectroscópicos já foram empregados como ferramentas eficientes em diversos estudos envolvendo a detecção de câncer. A espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier (FT-IR) já foi aplicada na discriminação de células e tecidos cancerígenos ou sangue de portadores da doença, sendo que o emprego dessa técnica requer o uso de algoritmos quimiométricos para obtenção de tais resultados. Os objetivos deste estudo foram analisar a concentração de cfDNA no plasma em portadores de câncer colorretal (CCR) e um grupo controle e empregar a análise discriminante com calibração multivariada por mínimos quadrados parciais (PLS-DA) com dados de FT-IR na discriminação de amostras de plasma de portadores de CCR e indivíduos saudáveis. Amostras de plasma de 15 pacientes de CCR e 15 controles foram utilizadas para isolar o cfDNA utilizando o sitema DNeasy Blood & Tissue Kit. Todas foram quantificadas no fluorímetro Qubit 3.0 com o Qubit dsDNA HS Assay Kit. As amostras de plasma foram diluídas numa razão 1:10 e alíquotas de 3 µL foram depositadas no cristal de leitura e desidratadas em corrente de ar (60-65ºC) por 1,5 min. As leituras foram realizadas em triplicata em espectrômetro Spectrum™ 400 FT-IR/FT-NIR no modo de refletância total atenuada (ATR-FTIR), na faixa de 650-4000 cm^-1, com resolução espectral de 4 cm^-1 e 8 pulsos de varredura. Os dados obtidos para a quantificação do cfDNA por fluorimetria foram analisados pelo teste U de Mann-Whitney. Os espectros foram normalizados e a análise multivariada foi realizada através da PLS-DA das triplicatas de cada amostra (n = 90) com diferentes tipos de pré-processamento, transformadas e quantidade de correções ortogonal de sinal (OSC) por meio da validação cruzada excluindo uma amostra por vez. Os critérios de seleção da melhor condição foram: erro quadrático médio de validação cruzada inferior a 1% (RMSECV = 0,01), menor número de fatores e de OSC para atingir esse erro, coeficiente de determinação (r²), acurácia, precisão e sensibilidade. A mediana (mínimo-máximo) para CCR foi de 177,8(148,8-440,0) ng/mL e estava significativamente aumentada em relação ao grupo controle, 118,4(67,6-154,2) ng/mL, pelo teste U de Mann-Whitney (p < 0,0001).  A melhor condição de PLS-DA foi obtida utilizando-se a 1ª derivada, 1 OSC e nenhum pré-processamento. Com apenas 1 fator, o modelo apresentou RMSECV = 0,0027 e r² = 0,9999. A acurácia, precisão e sensibilidade do modelo foram de 100%. O cfDNA demonstrou ser um potencial biomarcador diagnóstico de CCR, comparando-se os valores com um grupo controle. O emprego da regressão PLS-DA com dados da FT-IR mostrou alta acurácia na discriminação de amostras de plasma de portadores de CCR e indivíduos saudáveis diretamente do plasma, demostrando o potencial das técnicas como alternativa diagnóstica na prática clínica.