DESENVOLVIMENTO DE UMA QPCR CAPAZ DE IDENTIFICAR E DIFERENCIAR BACTÉRIAS GRAM POSITIVAS E GRAM NEGATIVAS A PARTIR DE AMOSTRAS BIOLÓGICAS DO SANGUE.

Resumo

 As infecções podem ser caracterizadas como uma condição local ou sistêmica, resultante de um desequilíbrio entre a presença de um agente infeccioso e, assim, evoluir para uma infecção da corrente sanguínea. Essas infecções podem causar complicações, causar aumento do tempo de internação e elevar os custos dos serviços de saúde. Métodos rápidos de diagnóstico molecular têm sido empregados na detecção do agente patogênico. Nesse sentido, a reação da polimerase em cadeia em tempo real (qPCR) tem sido utilizada para detecção de vários agentes infecciosos em vários materiais biológicos. O estudo teve como objetivo desenvolver uma qPCR capaz de identificar e diferenciar bactérias Gram positivas e Gram negativas a partir de amostras biológicas do sangue. Amostras de bactérias Gram positivas Staphylococcus aureus (ATCC 29213) e Escherichia coli (ATCC  25922), padrões da American Type Culture Collection, foram incubadas em caldo Brain Heart Infusion (BHI) por 37ºC durante 24 horas. Foram coletados 10 mL de sangue de indivíduos voluntários, em seguida, 500 uL do sangue foram transferidos para tubos estéreis e contaminados com colônias bacterianas na escala 1 de MacFarland (3x 10^8 UFC/mL) de S. aureus e E. coli. Foram realizados dois protocolos de extrações bacterianas: o primeiro foi realizado utilizando o kit comercial PureLink^® Genomic DNA (Invitrogen, EUA) seguindo as instruções do fabricante. Já, o segundo protocolo foi realizado por uma metodologia in house, o qual foi realizado conforme Bispo e colaboradores (2011). O DNA extraído foi quantificado através de fluorescência utilizando o kit High Sensitivit (Invitrogen, EUA) no equipamento Qubit^® 2.0 Fluorometer. A reação final da PCR uniplex continha 20 µL, sendo 10 µL de TaqMan Universal PCR Master Mix II (Applied Biosystems^®), 0,25 µM de cada primer, 2 µL de DNA bacteriano extraído e o volume final completado com água livre de nucleasse. Para a identificação de bactérias Gram negativas, utilizou-se 0,15 µM da sonda VIC e 0,15 µM de sonda NED para o controle interno; já para as Gram positivas utilizou-se 0,05 µM da sonda FAM e 0,15 µM da sonda NED. Utilizou-se também a beta-globina humana como controle interno. A amplificação foi realizada no equipamento StepOnePlus (Applied Biosystems^®) com as seguintes condições: 50 °C durante 2 minutos e 95 °C durante 10 minutos, seguido por 40 ciclos de 95 °C durante 15 segundos e 60 °C durante 1 minuto. A quantificação das amostras variou conforme cada método e o tipo de isolado bacteriano. Na primeira extração, a quantificação para o DNA total da amostra do sangue contaminado com o S. aureus foi de 7,5 ng/µL e para o sangue contaminado com a E. coli foi de 7,69 ng/µL. Já na segunda extração, a quantificação para o DNA total da amostra do sangue contaminado com o S. aureus foi de 2,76 ng/µL e para o sangue contaminado com a E. coli foi de 18,69 ng/µL. A qPCR apresentou só amplificação no controle interno de beta-globina nas amostras de sangue contaminadas com S. aureus e E. coli, indicando apenas presença de DNA humano e concentrações insuficientes de DNA bacteriano. Não foi possível desenvolver uma PCR capaz de identificar e diferenciar bactérias Gram positivas e Gram negativas a partir de amostras biológicas do sangue. Será necessário revisar as etapas do estudo, bem como os procedimentos de extração e da qPCR, realizar novas buscas na literatura, visando solucionar os problemas apresentados.