IDENTIFICAÇÃO DE TRÊS ESPÉCIES DE CANDIDA POR PCR EM TEMPO REAL

Resumo

Dentro das infecções geniturinárias, as causadas por Candida spp. se destacam como sendo muito prevalentes. A espécie C. albicans é a responsável pela maioria das infecções, porém outras espécies, incluindo C. glabrata e C. parapsilosis, vêm adquirindo importância crescente. Cada uma apresenta reações diferentes aos tipos de tratamento, assim torna-se essencial a identificação do patógeno específico causador da doença. O diagnóstico tradicional de infecções suspeitas de Candida spp. é feito através do crescimento em meio de cultura. Porém, esse método demanda tempo entre a entrada da amostra no laboratório e a liberação do laudo. A demora na obtenção dos resultados dificulta o tratamento do paciente, tornando-se necessário o desenvolvimento de novos métodos de diagnóstico mais rápidos. Nesse contexto, objetivou-se identificar três espécies de Candida através de PCR em tempo real (qPCR). No presente estudo, foram utilizadas amostras de DNA extraído de cepas de C. albicans (NEWP 0031), C. glabrata (ATCC 2001) e C. parapsilosis (ATCC 22019). O DNA foi quantificado no espectrofotômetro NanoDrop 2000c UV-Vis. Diluições das amostras em 20 ng/µL, 2 ng/µL, 0,2 ng/µL, 0,02 ng/µL, 0,002 ng/µL e 0,0002 ng/µL foram submetidas à reação de qPCR utilizando primers que amplificam a região espaçadora transcrita interna variável (ITS2) de cada espécie. O volume total da reação foi de 20 µL, utilizando-se 1 µL de amostra em cada tubo. Foram feitos controles negativos para cada conjunto de primers, utilizando-se o mix da reação e água ultrapura. A fim de confirmar o tamanho dos amplicons, realizou-se eletroforese em gel de agarose. A especificidade dos primers foi verificada por pesquisa das sequências complementares no programa BLAST. De acordo com a pesquisa, os primers se mostraram específicos para cada uma das espécies. A amplificação das sequências ocorreu em todas as amostras das três espécies de Candida, sendo que as amostras com concentrações de 1 ng/µL e 0,1 ng/µL apresentaram as melhores curvas de amplificação. O ciclo limiar (Ct) médio para C. albicans foi de 33,76±1,06 para 1 ng/µL e de 34,76±0,32 para 0,1 ng/µL, enquanto que para C. glabrata foi de 15,06±0,4 para 1 ng/µL e de 19,16±0,15 para 0,1 ng/µL. O Ct médio para C. parapsilosis foi de 13,76±0,25 para 1 ng/µL e de 17,75±0,91 para 0,1 ng/µL. A temperatura de dissociação (Tm) média para C. albicans, C. glabrata e C. parapsilosis foi respectivamente 73,68±2,37, 83,22±4,69 e 79,86±0,57. O Ct médio para todas as concentrações testadas de C. albicans foi elevado e as curvas de dissociação apresentaram picos que indicam a presença de produtos não específicos. Além disso, no gel de agarose há a presença de dímeros de primer. As curvas de dissociação de C. glabrata e C. parapsilosis também indicam a presença de produtos não específicos, porém nessas espécies não aparecem dímeros de primer no gel de agarose. As curvas de dissociação para as três espécies foram diferentes, indicando que os primers utilizados são capazes de discriminar a espécie de Candida presente na amostra. A verificação do tamanho dos amplicons em gel de agarose evidenciou que são de tamanhos distintos, sendo esses compatíveis com os esperados para cada espécie (108 pb para C. albicans, 84 pb para C. glabrata e 94 pb para C. parapsilosis). Conclui-se que o uso de qPCR possui grande potencial para identificação das três espécies, porém é necessária padronização para que se obtenha maior especificidade e reprodutibilidade.