O desenvolvimento de novas tecnologias e metodologias para a produção de energias limpas possui grande importância, principalmente para encontrar alternativas de matérias primas. Um dos materiais mais utilizados atualmente para a produção de biocombustíveis são as microalgas. A vasta composição bioquímica destes micro-organismos, especialmente o teor lipídico, os tornam potenciais fontes para a produção de biodiesel. O presente trabalho teve como objetivo a otimização do método de transesterificação enzimática in situ da microalga Desmodesmus subspicatus utilizando diferentes métodos de pré-tratamento da biomassa. A microalga foi cultivada em fotobiorretores internos, em meio N:P:K, com temperatura controlada e sob iluminação constante. Sua biomassa foi separada por centrifugação e posterior liofilização. A biomassa também foi caracterizada quanto à sua composição centesimal. Dois pré-tratamentos distintos foram realizados previamente ao início da reação de biotransformação: por ultrassom e por micro-ondas. A transesterificação enzimática foi realizada em reatores contendo metanol, hexano e água, utilizando-se 10% de lipase comercial como catalisador. A reação foi monitorada através da sonda de infravermelho ReactIR 15® por 48 horas, em intervalos de 5 minutos entre a coleta de cada conjunto de espectros. As amostras foram posteriormente analisadas por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM) para a identificação dos compostos formados. Utilizando-se o conjunto de espectros de infravermelho, pode-se plotar um gráfico tridimensional de cada ensaio, sendo monitorada a mudança de intensidade na região de 1300-1100 cm-1, correspondente ao estiramento da ligação C-O. Puderam ser observadas diferenças significativas nos tempos reação, uma vez que ambos os pré-tratamentos fizeram com que as reações mostrassem transformações em tempos inferiores comparando-se com a reação onde não ocorreu tratamento inicial à biomassa. O pré-tratamento com micro-ondas apresentou número maior de mudanças de intensidades em seus espectros de IV, indicando que substâncias diferentes estavam sendo liberado ao meio reacional, o que pode ser confirmado através da CG-EM, onde mais compostos orgânicos puderam ser encontrados. Embora o pré-tratamento tenha reduzido o tempo reacional, os principais ésteres de ácidos graxos encontrados nas diferentes reações foram os derivados do ácido oleico (18:1), ácido linoleico (18:2) e ácido linolênico (18:3), além do ácido palmítico (16:0), característicos da espécie de microalga utilizada. Assim, o pré-tratamento da biomassa utilizado na transesterificação enzimática in situ é eficiente em reduzir o tempo da reação, mostrando-se uma opção para otimizar o processo de produção de biodiesel a partir de microalgas.