EFEITO DA SOBRECARGA DE FERRO SOBRE A VIABILIDADE CELULAR EM ESTADO NORMOGLICÊMICO E HIPERGLICÊMICO EM CÉLULAS U87 DE GLIOBLASTOMA HUMANO
Resumo
A relação entre a homeostase da glicose e do ferro está sendo cada vez mais estudada e descrita na literatura, e a hipótese de que alterações em ambos os metabolismos como a hiperferritinemia e a diabetes mellitus estão relacionadas cada vez mais sendo consolidada. A sobrecarga de ferro leva à produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) e nitrogênio (RNS), que quando em desbalanço com os mecanismos antioxidantes e vias de reparo, podem levar à morte celular por apoptose, via ativação do p53 em resposta ao dano celular provocado por ROS e RNS. Uma das formas de avaliar a viabilidade celular é pelo ensaio colorimétrico com o reagente brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT), que produz cristais violetas quando metabolizado por células que possuem o metabolismo mitocondrial ativo. O objetivo desse estudo foi avaliar a influência da sobrecarga de ferro na viabilidade de células de glioblastoma em hiperglicemia e normoglicemia pelo ensaio de MTT. O experimento foi realizado com células da linhagem U87 de glioblastoma humano, cultivadas em meio completo contendo Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM, Sigma-Aldrich, Brasil), 10% de soro fetal bovino (FBS, Sigma-Aldrich, Brasil), e 1% de streptomicina/penicilina (Sigma-Aldrich, Brasil). As células foram cultivadas em uma placa com 96 poços a uma concentração inicial de 1x104 células/poço, com 200µL de meio suplementado em cada um. As células foram divididas em oito grupos: controle negativo/normoglicemia (CN); normoglicemia com sobrecarga de ferro em três diferentes concentrações (+Fe10µM; +Fe150µM; +Fe300µM); hiperglicemia (HG); e hiperglicemia com sobrecarga de ferro nas mesmas três diferentes concentrações (HG+Fe10µM; HG+Fe150µM; HG+Fe300µM). Para a indução do estado hiperglicêmico, foi adicionada glicose a uma concentração de 35mM. Para o teste, foram utilizados para cada poço 100µL do meio com o tratamento, que foi retirado após 2 horas. Foram então adicionados 100µL de solução de MTT; após 3 horas, a solução foi removida e a placa foi deixada para secar no período overnight. Foram adicionados 200µL de DMSO em cada poço e feita a leitura da absorbância em espectrofotômetro a 517 nm. A absorbância das células não tratadas foi considerada como 100% de viabilidade. Os resultados foram tabulados no programa GraphPad Prism 6.01 e analisados por ANOVA de uma via. A viabilidade celular se manteve em 100% para os grupos +Fe10µM, +Fe150µM, HG e HG+Fe10µM em comparação ao CN. A viabilidade celular se encontrou reduzida para os grupos +Fe300µM (92,1%), HG+Fe150µM (91,6%) e HG+Fe300µM (96,6%) em comparação ao CN. Ao analisar somente os grupos com hiperglicemia, houve uma redução na viabilidade a partir do grupo HG+Fe10µL (94,1%), efeito que se manteve nos grupos HG+Fe150µL (83,4%) e HG+300µL (90,6%) em comparação com o grupo HG. Embora a análise de comparações múltiplas tenha sugerido um efeito dose dependente dentro dos grupos em normoglicemia (150µM x 300µM; <0,001), esse fenômeno não foi observado nos grupos em estado hiperglicêmico. Nesse experimento, foi possível observar que as células em estado hiperglicêmico se encontram mais susceptíveis à sobrecarga de ferro em concentrações mais baixas, tendo a sua viabilidade diminuída. São necessárias mais repetições do teste para um resultado com maior poder estatístico.
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