AVALIAÇÃO DA QUANTIDADE E INTEGRIDADE DO CFDNA EM PACIENTES COM CÂNCER DE MAMA
Resumo
O DNA livre circulante (cfDNA) encontra-se na circulação sanguínea e sua liberação pode ocorrer através de diferentes eventos fisiológicos, como apoptose, necrose e secreção. Como biomarcador, o cfDNA, pode ser utilizado para detectar a integridade do DNA e monitorar pacientes com câncer. Objetivou-se assim avaliar a quantidade e integridade do cfDNA em pacientes com câncer de mama. Foram coletadas 19 amostras de sangue de mulheres com câncer de mama e 15 amostras de mulheres controles. Para a obtenção do plasma, foram realizadas duas centrifugações consecutivas. A extração de DNA foi desenvolvida através de uma adaptação de protocolos, extraído a partir de 200µL de plasma pré-tratado com uma solução de precipitação de proteínas do Wizard® DNA Purification System, utilizando-se o DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen). A quantificação do cfDNA foi realizado no fluorímetro Qubit® 3.0 (Thermo Fisher Scientific©) e expressa em ng/mL de plasma. O DNA genômico (gDNA) foi extraído de linfócitos através de sangue total de seis sujeitos pelo método de Salting out. O pool de gDNA foi preparado através mistura de 30 µL de gDNA de cada sujeito, quantificado no fluorímetro Qubit® 3.0 (Thermo Fisher Scientific©) e expresso em ng/mL de plasma. Para a qPCR foram utilizados dois conjuntos de primers de sequências Alu, um que amplifica sequências curtas, de 115 pb e o outro que amplifica sequências longas, de 247 pb. Para a quantificação das sequências Alu 115 e Alu 247 do cfDNA através da qPCR foi feita uma curva padrão com diluições seriadas (1:10; 1:100; 1:1.000; 1:10.000; 1:100.000; 1:1.000.000) de um pool de gDNA. O índice de integridade do cfDNA foi calculado pela razão entre a concentração de fragmentos de cfDNA longos (Alu 247 pb) e curtos (Alu 115 pb). Considerando o cfDNA total quantificado por fluorimetria, encontrou-se no grupo controle (n=15) média de 95,7±35,0 ng/mL e no grupo dos casos de câncer de mama (n=19) 85,1±45,7 ng/mL, não havendo diferença estatística significativa (p=0,45). Na análise da integridade do cfDNA calculada pela razão entre a concentração dos fragmentos longos (Alu 247) e fragmentos curtos (Alu 115), verificou-se que no grupo controle (n=15) obteve-se valor de 0,37±0,16 e no grupo dos casos (n=19) 0,57±0,45, sem diferença estatística significativa (p=0,07). O cfDNA e a integridade tem potencial para ser utilizado na discriminação dos pacientes com câncer de pessoas saudáveis, quando são avaliados em estágios mais avançados do câncer de mama, porém a falta de diferença estatística significativa no presente estudo pode ser, provavelmente, associada ao fato de que as pacientes, em sua maioria, são casos iniciais de câncer de mama.
