PADRONIZAÇÃO DA AMPLIFICAÇÃO DO GENE TET2 EM AMOSTRAS DE SANGUE PERIFÉRICO POR PCR
Resumo
A desregulação epigenética é uma característica presente em vários tipos de neoplasias, incluindo as neoplasias mieloides. O gene TET2 (metilcitosinadioxigenase 2) é considerado um regulador epigenético, catalisando a oxidação de 5-metilcitosina em 5-hidroximetilcitosina, levando à desmetilação do DNA e, assim, afetando a transcrição. As mutações com perda de função do gene TET2 são altamente prevalentes na leucemia mieloide crônica (LMC). Além disso, as mutações no gene TET2 causam desregulação epigenética clonal das células hematopoiéticas. A pesquisa da expressão de genes durante o processo carcinogênico pode auxiliar na compreensão da sua patogenia além de identificar alvos terapêuticos e marcadores de diagnóstico, prognóstico ou de estadiamento do paciente. Para isso, pode-se utilizar a técnica de PCR (polimerase chain reaction) que permite a amplificação de segmentos definidos da molécula de DNA. A PCR em tempo real (qPCR) é considerada um método mais eficaz do que o PCR convencional, pois possibilita o acompanhamento da amplificação do DNA em todo o seu processo, e não apenas no processo final, como ocorre com a PCR convencional. Sendo assim, a PCR em tempo real é considerada um procedimento de detecção e quantificação dos produtos que foram gerados durante cada ciclo de amplificação gênica. O objetivo principal deste estudo foi amplificar o gene TET2 por PCR convencional e em Tempo Real, por meio de RNA extraído de amostras de sangue humano. O RNA foi extraído através do método de Trizol, a partir de 3ml de sangue total. As quantificações das amostras foram lidas no espectrofotômetro L-QUANT (Loccus Biotecnologia), a partir de 2 uL do RNA extraído. O cDNA foi sintetizado a partir de 100ng de RNA usando o Kit SuperscriptIIRT®. A amplificação do gene TET2 foi primeiramente avaliada por PCR convencional, onde o produto final foi visualizado em gel de agarose 1% corado com brometo de etídeo. A PCR em Tempo Real foi realizada em um volume final de 20µl composto de 3,85µl água, 2µl tampão 10x, 1,2µl MgCl2 a 1,5mM, 0,1µl dNTP a 5mM, 0,4µl de cada primer a 10mM, 2µl SYBR green 100x diluído 1:100, 10µl de cDNA (diluído 1:15), 0,05µl Taq Platinum 0,05 uL. A reação foi executada em 45 ciclos através do sistema de qPCR StepOnePlusTM (ThermoFischer). A temperatura de anelamento foi de 59°C. Através destas condições utilizadas no experimento foi possível visualizar a amplificação do gene TET2 e a especificidade do amplicon foi observada através de um pico único na curva de melting. Foi possível padronizar a técnica de PCR convencional e PCR em tempo real para o gene específico.
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