O uso indevido e em excesso de antimicrobianos beta-lactâmicos tem se tornado um problema de saúde pública. Há um crescente surgimento de bactérias produtoras de enzimas da classe de beta-lactamases que confere resistência aos antibióticos beta-lactâmicos. Um importante mecanismo de resistência encontrado em cepas de bacilos gram-negativos é a produção de metalo-beta-lactamase (MBL). Estas pertencem a classe B de Ambler ou à classe 3 de Bush-Jacoby-Medeiros e hidrolisam todos os beta-lactâmicos comercialmente disponíveis, sendo a única exceção o monobactam e aztreonam. Os genes mais encontrados e com maior relevância clínica, em bactérias Gram negativas produtoras de MBL, são: bla_IMP, bla_SPM-1 e bla_NDM-1. A rápida detecção e identificação dessas bactérias resistentes é essencial na escolha da terapia antimicrobiana adequada e eficaz. Diante disso, a reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real é uma técnica que permite detectar o perfil de resistência bacteriana em uma amostra biológica em um curto período, quando comparado aos métodos microbiológicos convencionais. Além de agilizar os resultados dos exames, é considerada uma técnica promissora, pois apresenta alta sensibilidade e especificidade. O objetivo desse trabalho foi padronizar uma técnica de PCR em tempo real multiplex dos três principais genes MBL: bla_IMP, bla_SPM-1 e bla_NDM-1. Para realizar a padronização foram utilizadas cepas ATCC^® (American Type Culture Collection) de Escherichia coli (BAA 2452TM e ATCC 14621TM) e Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853TM), sendo elas semeadas em ágar Mueller Hinton e incubadas a 37°C por 24 horas. Posteriormente, realizou-se a extração do DNA microbiano, através de método de lise alcalina, conforme Millar e colaboradores (2000) com modificações, em que foi realizada somente uma lavagem com Tris-HCl e aumentou-se o número de rotações por minuto (rpm), para 14000 rpm, em todas as etapas de centrifugação. A PCR em tempo real foi realizada com o fluoróforo Sybr^®Green, na qual utilizou-se primers específicos para cada gene. A reação final foi de 20 µL, sendo 12,5 µL de GoTaq^® qPCR Master Mix (Promega^®), 0,2 µM de cada primer, 2 µL do DNA extraído e o volume completado com água livre deDNAse/RNAse. A PCR foi realizada no termociclador da DNA Technology^® nas seguintes condições: 50°C durante 2 minutos e 95°C durante 10 minutos; 40 ciclos de 95°C durante 15 segundos e 60°C durante 60 segundos; e um passo de curva de fusão (a partir de 68°C a 95°C, aumentando gradualmente 0,5°C/segundo). A partir disso, foi possível verificar através do software do próprio equipamento e padronizar a temperatura de melting (Tm) para cada um dos genes analisados. Após a realização da PCR em tempo real, observou-se a Tm e obteve-se os seguintes resultados: 81,3ºC para bla_IMP, 84,1ºC para bla_SPM-1 e 89,35ºC para bla_NDM-1. Diante do exposto, foi possível padronizar uma técnica de PCR em tempo real multiplex. Esta técnica é um importante recurso para o diagnóstico dos três principais genes de resistência da MBL. A perspectiva é transferir essa tecnologia para serviços de saúde, tais como hospitais e laboratórios.