PADRONIZAÇÃO DE UMA TÉCNICA PARA ANÁLISE DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DE EXTRATOS VEGETAIS ATRAVÉS DO ENSAIO ORAC

Resumo

O ensaio Oxygen Radical Absorbance Capacity (ORAC) é um método recente e inovador, que consiste em verificar a capacidade de amostras sequestrarem radicais livres (efeito antioxidante natural) frente ao radical peroxila, induzido pelo 2,2’-azobis-(2-metilpropanoamidina) (AAPH) a 37 ºC. O potencial desta atividade é medido pela sonda fluoresceína e comparado com um antioxidante padrão (trolox). Esse estudo propôs padronizar uma técnica para análise da atividade antioxidante de extratos vegetais de interesse dos projetos do Parque Tecnológico da Universidade de Santa Cruz do Sul (TecnoUNISC). As amostras utilizadas foram oleoresinas de pimentas das espécies Capsicum chinense (habanero) e Capsicum frutescens (malagueta). Foram preparados o diluente tampão fosfato 75mM (pH 7,4), a solução estoque de fluoresceína 407 µM e a solução estoque de trolox 4000 µM em tampão fosfato. A partir desta última solução, foi realizada uma diluição seriada para obter concentrações de 2 a 96 µM de trolox (P1 a P10). Em uma microplaca de 96 poços escura (Fluotrac 200, Greiner bio-one®) foram adicionados 25 µL das oleoresinas (50 ppm) ou 25 µL de do padrão trolox em diferentes concentrações (P1 a P10). Posteriormente, foi adicionado 150 µL de fluoresceína (81 nM) e o sistema foi incubado (SpectraMax® M3) por 10 minutos a 37 ºC, sendo os 3 últimos minutos sob constante agitação. Após essa etapa, foram adicionados 25 µL da solução de AAPH (152 mM) recém preparada como fonte geradora de radicais peroxila. Foram feitos brancos para analisar a integridade da placa, dos reagentes e da ação natural do AAPH na sonda fluoresceína. O volume final de cada poço foi de 200 µL. A fluorescência foi monitorada a cada minuto (excitação = 485 nm e emissão = 528 nm), durante 91 minutos a 37ºC na leitora de placas (SpectraMax® M3). A capacidade antioxidante foi determinada pela área sob a curva (AUC) e os resultados foram comparados com a curva padrão de Trolox (0 – 96 µM) e expressos em “µmol de Trolox Equivalente (TE) por grama de amostra” e “grama de trolox por grama de amostra”. Todas as análises foram realizadas em triplicata, com estatística descritiva (média e desvio padrão) e pelo teste de análise de variância (ANOVA) com post-hoc de Tukey, utilizando o programa Origin Pro 8.5 ao nível de 5% de probabilidade. As oleoresinas das espécies C. frutescens e C. chinense apresentaram 603,746 e 550,210 µmol de Trolox equivalente (TE) por grama de oleoresina. Quando comparados ao padrão utilizado, para terem efeitos equivalentes na atividade antioxidante, deve-se dosar 7,26 g da oleoresina de C. chinense e 6,61 g da oleoresina de C. frutescens para cada grama de trolox. A pimenta malagueta foi a que apresentou maior atividade antioxidante. Foi desenvolvido um protocolo desta técnica e uma planilha genérica para calcular e interpretar os resultados do ensaio ORAC.