COMPARAÇÃO DE 4 MÉTODOS DE EXTRAÇÃO DE DNA DE LEVEDURAS DO GÊNERO CANDIDA EM AMOSTRAS CLÍNICAS DE SECREÇÃO VAGINAL

Resumo

Espécies de Candida são fungos comensais da pele e dos tratos gastrointestinal e vaginal humano e animal. Todavia, quando ocorre um desbalanço da microbiota normal ou do sistema imune do hospedeiro encontra-se comprometido, esses organismos tendem a causar manifestações sintomáticas tais como leucorreia, prurido e dispareunia. Embora usualmente o tratamento seja empírico, em casos de recorrência ou severidade dos sintomas é necessário o diagnóstico a partir da identificação do agente causal. Este diagnóstico é realizado a partir de amostras de fluidos corporais e tecidos lesados, porém apresenta uma série de limitações como a demora na obtenção dos resultados e a possível contaminação da amostra e do cultivo. A identificação do agente causal em nível de espécie é importante porque mecanismos de resistência a antifúngicos são diferentes entre elas. A reação em cadeia da polimerase (PCR) é um método rápido e de alta sensibilidade, porém requer uma extração de DNA do patógeno de boa qualidade. A obtenção do DNA do patógeno a partir do fluido corporal ou tecido lesado permite a sua identificação pela PCR diretamente, sem requerer a etapa de cultivo. O objetivo do trabalho foi comparar 4 métodos de extração do DNA leveduriforme obtidos diretamente de fluido de secreção genital de 41 mulheres submetidas a exames de rotina do Sistema Integrado de Saúde (SIS) da UNISC. Os métodos de extração foram modificados na etapa da disrupção da parede da levedura que representa uma etapa crítica na obtenção do DNA do microrganismo. Assim, foram utilizados os seguintes procedimentos: Nitrogênio + Proteínase K (N+PK); Nitrogênio + CTAB (N+CTAB); Lyticase + CTAB (Lyt+CTAB); Lyticase + Proteínase K (Lyt+PK). O DNA extraído foi quantificado através de espectrofotometria e teve sua qualidade avaliada pela relação 260/280nm no espectro do ultravioleta, eletroforese em gel de agarose e PCR. Foi utilizado o teste de Kruskall-Wallis seguido do pós-teste de Dunn para a comparação das variáveis quantitativas. A mediana e os limites mínimo-máximo da extração do DNA pelo método Lyt+PK foi de 122,7(23,2 – 281,7) ng/µL representando uma quantidade significativamente maior que os demais métodos, N+PK 5,5(1,0 - 68,1); N+CTAB 3,9 (0,2 – 122,2) e Lyt+CTAB 29,6(4,3 – 164,0). Em relação a qualidade avaliada pela relação 260/280nm também o método Lyt+PK foi melhor que os demais, pois sua mediana e limites mínimo-máximo foi de 1,79(1,42 – 1,91), ou seja, próximos da faixa ideal que varia de 1,8 a 2,0, enquanto que para os demais os valores foram de: N+PK 1,43(0,71 – 2,12); N+CTAB 1,40(0,44 – 2,38); Lyt+CTAB 1,54(0,62 – 2,14). Todas as amostras que tinham concentrações aceitáveis para visualização em gel de agarose foram detectadas, independentemente do método de extração. A PCR com oligoiniciadores para DNA humano e de Candida resultou em amplicons de fácil visualização quando o DNA foi extraído pelo método de Lyt+PK sugerindo que este método é eficiente para técnicas moleculares como a PCR. Conclui-se que o método PK+Lyt é eficiente e para extração do DNA de Candidas e pode ser usado diretamente em amostras de fluidos vaginais para posterior PCR.