DESENVOLVIMENTO DE UMA PCR EM TEMPO REAL PARA A IDENTIFICAÇÃO DO CITOMEGALOVÍRUS

Resumo

Introdução: O Citomegalovírus Humano (CMV) é patógeno oportunista que normalmente é inofensivo. No entanto, para indivíduos imunocomprometidos ele se torna uma ameaça, pois o seu sistema imune se encontra ineficiente ou imaturo, como é o caso de recém-nascidos. A transmissão vertical do CMV da mãe para o feto é responsável pela infecção congênita que resulta em problemas neurológicos congênitos no feto. O combate à infecção é realizado através da utilização de medicamentos antivirais e do diagnóstico viral rápido. Nesse sentido, a técnica considerada padrão ouro para o diagnóstico da infecção congênita causada pelo CMV é a PCR tempo real, pois ela possui alta sensibilidade e mais precisão que os outros testes de diagnósticos para CMV. Objetivo: desenvolver uma técnica de PCR em tempo real in house para a identificação do citomegalovírus em urina de recém-nascidos. Metodologia: trata-se de um estudo experimental, no qual utilizou-se uma amostra de urina de um recém-nascido com diagnóstico comprovado de infecção congênita por CMV. A amostra de urina foi submetida ao processo de extração de DNA através do protocolo de purificação de DNA a partir de amostras de urina utilizando o kit comercial QIAamp® DNA Mini Kit conforme instruções do fabricante. Após, foi realizada a quantificação de DNA das amostras através do equipamento Nano Drop (ThermoScientific Nano Drop 2000c). Foi realizado uma PCR em tempo real pelo método SYBR® Green utilizando os primers do gene UL83 do CMV, primer direto 5'-CCC TCC GGC AAG CTC TTT-3' e primer reverso 5'-CAG GTC CTC TTC CAC GTC AGA-3'. A mistura para PCR continha 12,5µl de SYBR® Green, 0,08 µM de cada primer, 5µl de DNA, para um volume final de 25µl. As condições de ciclagem foram as seguintes: 1 ciclo de 50ºC durante 2 minutos, 95ºC durante 10 minutos, seguido de 50 ciclos de 95ºC durante 15 segundos e 60º para 1 minuto. Controle negativo e amostras do teste foram realizados em duplicatas. Resultados: foi obtido alíquotas de amostras intituladas controle positivo A (C⁺A), controle positivo B (C⁺B) e controle positivo C (C⁺C) com quantificação de ácidos nucleicos 14,1 ng/µl, 14,6 ng/µl e 4,6 ng/µl, respectivamente. A partir da técnica de PCR em tempo real SYBR® Green obteve-se curva de amplificação nas amostras C⁺A, C⁺B e C⁺C iniciando entre o 28º e 30º ciclo limiar de amplificação (Ct). Conclusão: a partir dos dados obtidos podemos afirmar que foi possível desenvolver uma PCR em tempo real SYBR® Green para a identificação do Citomegalovírus humano em amostra clínica de urina considerada positiva para CMV. No entanto, é necessário a realização de mais testes para a validação da técnica.