DESENVOLVIMENTO DE PROTOCOLO DE DIAGNÓSTICO, BASEADO EM BIOLOGIA MOLECULAR PARA A DETECÇÃO DE COVID-19 EM SANTA CRUZ DO SUL

Resumo

Introdução: O vírus SARS-CoV-2 é responsável por causar uma séria infecção denominada covid-19. As manifestações clínicas da doença podem variar desde totalmente assintomáticas até casos com sintomas críticos e letais. O coronavírus destacou-se pelo seu alto potencial de disseminação em massas e pela sua alta taxa de transmissibilidade, gerando um alto impacto na saúde pública. Nesse contexto, a Organização Mundial da Saúde (OMS) estabeleceu que identificar o real número de infectados é uma medida importante de enfrentamento ao vírus. Diversos protocolos foram desenvolvidos, sendo o teste recomendado e considerado padrão-ouro é aquele que utiliza a biologia molecular e se baseia na reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa (RT-PCR), com detecção em tempo real. O primeiro protocolo disponibilizado e validado pela OMS foi o desenvolvido pelo Instituto de Virologia de Charité. Como recomendado pelo protocolo, a confirmação se baseava na recomendação de dois alvos diferentes, o gene E e o gene RdRP. Porém, verificou-se uma maior agilidade para a confirmação laboratorial quando utilizado o gene E isoladamente. Objetivo: Desenvolver um protocolo de diagnóstico, baseado em biologia molecular para a detecção de covid-19 como estratégia de ação para o controle da pandemia no município de Santa Cruz do Sul. Metodologia: Para o desenvolvimento da padronização do protocolo, foram utilizadas amostras provenientes da rotina de diagnóstico implementada no TecnoUnisc para contribuir com o município no combate a pandemia. As amostras foram coletadas de secreção nasal e da garganta de pacientes por profissionais, através de swabs. A extração dos ácidos nucleicos é realizada por automação, com o equipamento EXTRACTA 32 da Loccus, utilizando o kit comercial MagMAX CORE Nucleic Acid Purification Kit™. A RT-PCR se baseou na detecção de sequências de RNA viral envolvendo três fases, a desnaturação, o anelamento e a polimerização. Tudo isso é feito em um termociclador, utilizando ciclos que alternam temperaturas, para que cópias do gene sejam amplificadas de maneira exponencial. O protocolo se baseia no método Charité e acatando a recomendação da Organização Pan-Americana de Saúde (OPAS) utiliza-se apenas um gene-alvo, o E. Para obter resultados quantitativos nos testes, é utilizado um limiar de detecção, denominado threshold. A linha de amplificação da amostra cruza com o threshold e nos permite denominar o número necessário de ciclos para o início da amplificação da sequência gênica-alvo. Este valor é chamado de Ct (“Cycle Threshold”) e permite a quantificação relativa de DNA. Principais resultados: Desde a implementação da rotina em abril de 2020 até agosto de 2021, foram processadas mais de 9.720 amostras, das quais 2.783 (28%) testaram positivo para o coronavírus e 63 (0,64%) apresentaram resultado inconclusivo. Devemos levar em consideração as diversas variáveis que levam uma amostra a ser inconclusiva ou sofrer repetição. Por ser um material extremamente sensível, o RNA é altamente degradado e deve ser manipulado com muito cuidado. Conclusão: Conclui-se que o protocolo de diagnóstico molecular foi válido e eficaz para a confirmação de novos casos de COVID-19 em Santa Cruz do Sul. Entretanto possui algumas limitações, como o custo elevado para a realização dos testes, aproximadamente R$ 60,00 somente para os reagentes. Além disso, requer uma infraestrutura com equipamentos específicos e recursos humanos experientes e qualificados.