PADRONIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE PCR PARA O GENE CYP2D6

Resumo

O tamoxifeno é a terapia hormonal mais usada nas últimas três décadas no tratamento do câncer de mama (CM) hormônio-dependente e, mais recentemente, na prevenção de CM em mulheres de todas as idades. Sua atividade farmacológica depende da sua bioativação pelo citocromo P450 2D6 (CYP2D6). Os resultados clínicos da terapia com tamoxifeno são influenciados por diversos fatores, incluindo o genótipo metabolizador CYP2D6, aderência ao tratamento e o uso de co-medicações inibidoras, como os antidepressivos. Vários estudos sugerem que mulheres que transportam uma ou duas variantes alélicas do CYP2D6, que codificam enzimas com atividade reduzida ou nula podem ter um pior desfecho clínico quando tratadas com terapia adjuvante com tamoxifeno em comparação às mulheres portadoras de dois alelos com função normal. O objetivo do presente trabalho é padronizar a técnica de PCR-RFLP para análise de prevalência do polimorfismo CYP2D6*4 em amostras de sangue total de pacientes com câncer de mama. Foi realizado um estudo transversal no qual a população do estudo foi constituída por 20 mulheres com diagnóstico de câncer de mama confirmado por exame anatomopatológico, com ou sem estudo imuno-histoquímico, atendidas no Centro de Oncologia Integrado (COI) do Hospital Ana Nery. As mulheres foram convidadas a participar do estudo e concordaram mediante assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE). Todas responderam a um questionário com dados epidemiológicos e foram submetidas a uma coleta de sangue. O DNA genômico foi extraído a partir do sangue total pelo método Salting out e as genotipagens foram padronizadas conforme descrito por Sobtia et al (2005). Os primers utilizados na reação em cadeia da polimerase (PCR) foram: CYP2D6-F - 5'gcc ttc gcc aac cac tcc g3' e CYP2D6-R - 5'aaa tcc tgc tct tcc gag gc3'. O tamanho do fragmento gerado foi de 334 pb e os produtos da PCR foram visualizados em gel de agarose 2,0% com marcador de peso molecular de 100 pares de base. Para a padronização da PCR in house, foram utilizados para cada reação 5µL de tampão de PCR (10 X: 200mM de tris - HCl, pH 8,0; 50 mM de HCl 10 X concentrado); 1,5 µL(1,5mM) MgCl₂; 2µL (20µM) de dNTPs; 2µL(20pmol) de cada iniciador; 2,5U de taq polimerase; água ultra pura para completar o volume de 50µL. Foram testadas as seguintes condições para padronização da amplificação do gene: primeira condição de PCR testada: desnaturação inicial de 94°C por 5 min, 30 ciclos de 94°C por 20 seg, 56°C por 30 seg e 72°C por 40 seg e por fim extensão final 72°C por 6 min. Obtivemos fragmentos com fraca intensidade, dessa forma foi reduzido 1ºC na temperatura de anelamento no sentido de aumentar a intensidade de DNA do fragmento; o resultado se manteve o mesmo. Terceira condição testada: alteramos a quantidade de MgCl₂ para 2,0 µL e mantivemos as demais condições com o objetivo de aumentar a intensidade do fragmento; obtivemos bons resultados. A terceira condição testada se mostrou satisfatória, mas ainda é necessário otimizar as condições para que seja possivel dar seguimento na padronização da clivagem com enzima de restrição para identificação do polimorfismo. A padronização e avaliação de técnicas de biologia molecular no diagnóstico de polimorfismos de câncer no Brasil são imprescindíveis na discussão da implantação deste exame na rotina diagnóstica em centros de referência.