O Rio Pardinho constitui importante recurso hídrico que abastece a região do Vale do Rio Pardo. Em relação às águas da Bacia Hidrográfica do Rio Pardo, dados do Comitê Pardo mostram que a influência antrópica é determinante na perda da sua qualidade. Sabe-se que ambientes aquáticos podem estar sofrendo alterações que não são perceptíveis, pois os danos podem estar em nível celular e molecular. Nesses casos, testes genotóxicos, como o Ensaio Cometa (EC), que avalia lesões em nível de DNA, mesmo em situações em que a vitalidade e viabilidade não estejam comprometidas, podem sugerir alterações ambientais causadas por agentes tóxicos. O objetivo do trabalho foi avaliar o potencial genotóxico de quatro pontos amostrais no Rio Pardinho (P1, P2, P3 e P4) no inverno e primavera do ano de 2012, utilizando o EC com Astyanax fasciatus. O P1 localiza-se próximo à nascente, enquanto P4 está próximo à foz do rio. Em cada ponto foram coletados, em média, 12 indivíduos por ponto e estação do ano. Amostras de sangue periférico foram obtidas por punção cardíaca e armazenadas em gelo ao abrigo da luz até a realização do EC. Foi utilizada a versão alcalina do EC adaptado de Groff et al. (2010). A coloração das lâminas foi feita com solução de nitrato de prata e as lâminas analisadas na microscopia óptica (100X). Os nucleóides foram classificados em cinco classes: classe 0 (sem dano) até classe 4 (dano máximo). Após, foi calculado a Frequência de Danos (FD) e o Índice de Danos (ID), sendo a análise estatística realizada no software GraphPad Prism 5.0, utilizando o teste de Kruskall-Wallis, seguido do pós-teste de Dunn para múltiplas comparações. Os resultados sugerem que o P1 é o menos impactado, pois apresentou o menor ID nas 2 estações avaliadas, provavelmente por estar localizado em zona rural caracterizada por pequenas propriedades com atividade agropecuária. O P2 se localiza em área rural caracterizada por muitas lavouras de tabaco e milho ao seu entorno, o que sugere a possibilidade de que agroquímicos possam ser lixiviados para o leito do rio, sendo esse o principal fator impactante a ser considerado nesta área. Ao se tratar do P3, este se encontra em área urbana e sofre grande influencia dos arroios que cortam o município de Santa Cruz do Sul e que trazem os efluentes domésticos, urbanos e industriais, acabando por desembocar imediatamente antes do ponto de coleta. Já o P4 se localiza em área rural após os grandes centros urbanos da região e com lavouras de arroz e pecuária ao seu entorno. Este ponto é considerado pela FEPAM-RS como área crítica de poluição ambiental. Os resultados do EC sugerem que o ID não aumenta gradativamente da nascente em direção à foz, pois no inverno o ID do P2 foi o mais elevado, ficando semelhante ao do P4. Já na primavera o aumento do ID foi gradativo da nascente em direção à foz. Em relação à FD, constatou-se que somente o P1 estava significativamente menor que os demais pontos de coleta nas duas estações. A localização dos pontos pode ser útil para indicar os potenciais contaminantes presentes ao longo do Rio Pardinho. Os resultados obtidos sugerem que não são apenas os grandes centros urbanos que contribuem para contaminação dos corpos hídricos. Assim, o EC realizado em A. fasciatus demonstrou ser uma ferramenta potencial para o biomonitoramento ambiental, evidenciando alterações em locais que não aparentam estarem comprometidos, como neste trabalho foi o caso do P2, que é utilizado para lazer e pesca pela população.