Bactérias produtoras da enzima beta-lactamase de espectro estendido (ESBL) têm se tornado um fator preocupante na saúde pública, devido a sua limitação na escolha terapêutica, uma vez que já se mostram capazes de hidrolisar os antibióticos beta-lactâmicos como cefalosporinas de terceira e quarta geração, além de penicilinas e aztreonam. O uso contínuo e indevido desses fármacos no tratamento de enterobactérias é responsável pela ocorrência de mutações na enzima ESBL, essa por sua vez, acaba expandindo sua atividade e aumentando a resistência das bactérias frente aos novos antimicrobianos desenvolvidos. A produção dessa enzima é dada através da transferência plasmidial, na qual pode ser codificada por uma variedade de genes tais como o bla_TEM, bla_SHV e bla_CTX-M. Com a proposta de auxiliar no diagnóstico dessas infecções e facilitar a escolha de uma terapia medicamentosa adequada, os métodos moleculares como a reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real, apresenta vantagens quando comparada com as técnicas microbiológicas convencionais, devido a alta sensibilidade e especificidade, além disso, uma reação multiplex é capaz de detectar diferentes genes ao mesmo tempo. O objetivo desse trabalho foi padronizar uma PCR em tempo real multiplex para os três genes ESBL clinicamente mais importantes: bla_TEM, bla_SHV e bla_CTX-M. Para realizar a padronização, foi utilizada uma cepa clínica doada pelo Hospital Santa Cruz, que foi responsável pela realização dos testes fenotípicos. Na sequência, a amostra foi incubada em caldo Brain Heart Infusion por 37ºC durante 24 horas e posteriormente, semeada em Ágar Mueller Hinton e incubada nas mesmas condições anteriores. A extração do DNA bacteriano foi realizada pelo método de lise alcalina, conforme Millar e colaboradores (2000) com modificações. A PCR em tempo real, por sua vez, foi padronizada com o fluoróforo Sybr^®Green, na qual utilizou-se primers específicos para cada gene. A reação final foi de 20 µL, sendo 12,5 µL de GoTaq^® qPCR Master Mix (Promega^®), 0,2 µM de cada primer, 2 µL do DNA extraído e o volume completado com água livre de nuclease. A PCR foi realizada no termociclador da DNA Technology^® nas seguintes condições: 50°C durante 2 minutos e 95°C durante 10 minutos; 40 ciclos de 95°C durante 15 segundos e 60°C durante 60 segundos; e um passo de curva de fusão (a partir de 68°C a 95°C, aumentando gradualmente 0,5°C/segundo). A partir disso, pode-se verificar a temperatura de melting para cada um dos genes estudados, sendo essas iguais a 85ºC, 88,5ºC e 91,3º para os genes bla_TEM, bla_CTX-M e bla_SHV, respectivamente. Diante do exposto, foi possível padronizar uma técnica de PCR em tempo real capaz de diferenciar três importantes genes produtores da enzima ESBL, garantindo a detecção do perfil de resistência bacteriana. Ainda, tem-se como perspectiva, a transferência de tecnologia para serviços de saúde como hospitais e laboratórios, a fim de auxiliar no diagnóstico de forma mais sensível e específica.