As bactérias colonizam naturalmente os seres humanos, no entanto, alguns desses microrganismos podem tornar-se patogênicos podendo causar infecção. Dentre essas bactérias tem-se o Staphylococcus aureus, o qual é encontrado na pele e nas fossas nasais e o Enterococcus faecium, geralmente encontrado no trato intestinal. Devido ao uso indiscriminado de antimicrobianos, a resistência microbiana tem aumentado significativamente. Essa resistência dificulta o tratamento dos pacientes, ocasionando em um maior tempo de tratamento, assim como possíveis falhas no mesmo. Geralmente, essas bactérias acometem pessoas em ambientes hospitalares, tanto pacientes quanto profissionais da saúde. Dentre as resistências dos Staphylococcus aureus, a resistência a meticilina é uma das mais prevalentes e é conhecida como MRSA que é codificada pelo gene MecA. Já, o Enterococcus faecium tem apresentado resistência à vancomicina, conhecido como VRE. Essa resistência pode ser codificada por diversos clusters, como o VanA, VanB e VanC. A fim de otimizar o tempo de diagnóstico de resistência bacteriana, a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) em tempo real tem sido uma técnica promissora, pois possui alta sensibilidade e especificidade. Com isso, o objetivo do estudo foi padronizar uma PCR em tempo real para identificar os genes de resistência de MecA e VanA. Realizou-se um estudo com amostras de bactérias Gram positivas padrões da American Type Culture Collection. As cepas utilizadas foram Staphylococcus aureus MecA(ATCC 33591) e Enterococcus faecium VanA (ATCC BAA-2317). Essas cepas foram semeadas em Ágar Muller Hinton e incubadas por 24 horas a 37°C. Em seguida, foi realizada a extração de DNA bacteriano através da técnica de lise alcalina, descrita por Millar e colaboradores (2000), com adaptações no número de rotações por minuto em cada centrifugação e lavagem única com Tris-HCL. A reação final da PCR uniplex continha 20 µL, sendo 12,5 µL de GoTaq qPCR Master Miix (Promega®), 0,2 µM de cada primer, 2 µL de DNA bacteriano extraído e o volume final completado com água livre de nuclease. A qPCR foi realizada no termociclador da DNA Technology® nas seguintes condições: 50 °C durante 2 minutos e 95 °C durante 10 minutos; 40 ciclos de 95 °C durante 15 segundos e 60 °C durante 60 segundos, e um passo de curva de fusão (a partir de 68 °C a 95 °C, aumentando gradualmente 0,5 °C/segundo). A temperatura de melting do gene MecA foi de 75,7°C e do gene VanA foi de 85,3°C. Através dos resultados obtidos, pode-se observar que foi possível realizar a padronização da reação uniplex, tendo perspectivas de padronização para reações multiplex.