PADRONIZAÇÃO DA TÉCNICA DE PCR PARA AMPLIFICAÇÃO DO GENE DPYD

Resumo

O câncer colorretal tem se mostrado um grave problema para saúde pública a nível mundial, vários autores têm dedicado seus estudos a essa importante patologia. Dentre os fatores genéticos estudados está a dihidropirimidina desidrogenase (DPD), enzima codificada pelo gene DPYD, responsável pela degradação e inativação de 80% do 5 fluoracil (5-FU, quimioterápico amplamente utilizado). A redução da atividade da DPD pode levar ao acúmulo do metabólito ativo do 5-FU, podendo levar à diminuição da eficácia do fármaco e/ou ao aumento do risco de severa toxicidade. A mutação no sítio de splicing do íntron 14 (IVS14 +1 G> A) leva ao salto do éxon 14 no processo de splicing pré-mRNA de DPYD. Como resultado, o mRNA maduro de DPYD carece de um nucleotídeo no segmento de codificação de aminoácidos. Van Kuilenburg e colaboradores (2002) demonstraram que a mutação era quase completamente confinada ao grupo de pacientes com diminuição da atividade de DPD e 44% destes pacientes foram portadores desta mutação. Estudos demonstram que os portadores da mutação IVS14 +1 G> A correm maior risco de desenvolver toxicidade grave após a administração de 5-FU. Desta forma, é muito importante que se realize a técnica de PCR para identificação desta mutação, melhorando a qualidade do tratamento dos pacientes. O objetivo do presente trabalho é padronizar a técnica de PCR-RFLP para análise de prevalência do polimorfismo IVS14+1 G>A em amostras de sangue de pacientes com câncer colorretal. As amostras estão sendo coletadas no Centro de Referência em Oncologia do Hospital Ana Nery, localizado na cidade de Santa Cruz do Sul. No laboratório de genética e biotecnologia da Universidade de Santa Cruz do Sul, o DNA extraído a partir das amostras de sangue utilizando a técnica de Salting Out (Muller, 1988). Um produto 334 pares de base foi gerado por uma Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) utilizando os primers F -5'TCCTCTGCAAAAATGTGAGAAGGGACC-3' e R - 3'TCACCAACTTATGCCAATTCTC-5' descrito por Ofherholm et al. (2010). Os produtos da PCR foram visualizados em gel de agarose 2% com marcador de peso molecular de 100 pares de base. Para analisar os polimorfismos na região codificante do éxon 14 do gene DPYD, foi realizada a reação conforme descrito na bula da enzima Taq polimerase, onde foram testadas nas seguintes condições: 5 µL de tampão de amostra (10X), 4 µL de DNTP mix (10 mM), 1,5 µL de MgCl₂, 0,5 de cada primer (10 pmol), 0,5 µL da enzima Taq DNA polimerase (0,5U), 33 µL de água estéril e 5 µL de DNA molde (100 a 200 ng) nas seguintes temperaturas de anelamento 35 ciclos de 5 mim desnaturação inicial estão em 94 C, 95°C por 1min, 55°C por 1min, 72°C por 1min e 5 min extensão final estão em 72 C. Nestas condições foi possível amplificar o fragmento de interesse, entretanto a intensidade do fragmento ainda não é satisfatória para que seja possível passar para a próxima etapa da análise, o RFLP com a enzima de restrição Taq DNA polimerase. A padronização da técnica ainda está em andamento, necessitando de adaptações do protocolo para que se obtenha um fragmento com maior quantidade de DNA para posteriormente realizar a restrição para identificação do polimorfismo IVS14+1G> A. Este estudo é de suma importância, pois identificada a mutação poderemos melhorar a qualidade do tratamento dos pacientes.