COMPARAÇÃO DA EFICIÊNCIA DE DIFERENTES MÉTODOS DE EXTRAÇÃO DE DNA PARA OBTER DNA LIVRE DE CÉLULAS (CFDNA) A PARTIR DE AMOSTRAS DE PLASMA HUMANO

Resumo

A obtenção de um cfDNA de qualidade a partir de plasma sanguíneo é uma etapa fundamental para a realização da PCR utilizada em biopsias líquidas. Com esta tecnologia, é possível amplificar sequências específicas através da PCR para detectar mutações gênicas, vírus, bem como determinar a sua origem na circulação, se é proveniente de necrose ou apoptose. Essa Última permite acompanhar pacientes oncológicos e a progressão da doença através da avaliação da integridade do cfDNA. Metodologias específicas para sua obtenção são de custo elevado e novas alternativas devem ser propostas e padronizadas. Os objetivos são: desenvolver um método de obtenção de cfDNA in house a partir do plasma; comparar a sua eficiência com outros 2 métodos comerciais e 2 in house já descritos; determinar se o cfDNA obtido pode ser utilizado nas reações de PCR em tempo real. Foram coletadas 10 amostras de sangue total com EDTA de pessoas saudáveis. O plasma final foi obtido por duas centrifugações em sequência. A primeira ocorreu a 1.300 g por 20 min a 10°C e, imediatamente após, foi feita nova centrifugação do sobrenadante a 15.500 g por 10 minutos a 10°C para minimizar qualquer contaminação por restos celulares. Este procedimento deve ser feito em até 2 horas após a coleta do sangue. Foram testados 4 métodos de extração: 2 kits comerciais e 2 protocolos in house. Os kits testados foram NucleoSpin (NS) XS Plasma (Macherey-Nagel) e Wizard Genomic (WG) DNA Purification (Promega). Os protocolos in-house testados foram o método de iodeto de sódio (Nal) e o método de tiocianato de guanidina (GuSCN) e sílica. O método in house desenvolvido foi gerado a partir do protocolo de GuSCNe sílica com algumas alterações: alteração na composição da solução de lise, aumento do tempo de incubação após a adição da solução de sílica e aquecimento do tampão de eluição a 42ºC. As amostras analisadas por espectrofotometria no Nanodrop 2000C e em gel de agarose. Amostras do protocolo da extração de GuSCN e sílica foram submetidas a PCR em tempo real, utilizando-se dois conjuntos de primers distintos que geram amplicons de 111 pb e de 260 pb da família gênica Alu. A amplificação foi confirmada por eletroforese com gel de agarose 1,5%. O resultado das quantificações dos protocolos testados em ng/µl foi: NS (36,8 ± 31,9); WG (37,0 ± 29,8); Nal (100,1 ± 42,2); sílica com GuSCN (15,9 ± 16,6). A qualidade da extração foi avaliada pela relação 260/280 nm: NS (2,30 ± 1,34); WG (0,86 ± 0,138); Nal (0,9 ± 0,06); sílica com GuSCN (1,77 ± 0,45). As modificações no protocolo GuSCN e sílica aumentaram seu rendimento (média de 24,3ng/µl) em relação às adaptações iniciais. Foi realizada a reação de PCR em tempo real com amplificação positiva para ambos amplicons (260 pb e 111 pb) também confirmadas em gel de agarose. Na comparação dos 4 métodos de obtenção de cfDNA, conclui-se que apesar do método Nal parecer ter um rendimento elevado, a relação 260/280 sugere elevados níveis de contaminantes, bem como o Wizard Genomic Kit. Portanto, o método mais promissor é o GuSCN e sílica. Apesar de não ter altos rendimentos, a relação 260/280 foi muito perto do ideal (1,8-2). Além disso, as suas vantagens incluem ser um método in-house com uma execução rápida e de baixo custo. Com as alterações realizadas neste protocolo, mostrou-se muito mais eficiente no seu rendimento. O cfDNA obtido pelo método de GuSCN e sílica pode ser utilizado em reações de PCR em tempo real.