UTILIZAÇÃO DA TÉCNICA DE QPCR PARA IDENTIFICAÇÃO E DIFERENCIAÇÃO DE ESPÉCIES DE CANDIDA

Resumo

Leveduras do gênero Candida fazem parte da microbiota natural em humanos, ocorrendo principalmente na pele e mucosas. Assim, qualquer desequilíbrio nos mecanismos de defesa pode tornar esses microrganismos patogênicos. O diagnóstico fúngico geralmente ocorre através da cultura de fluidos corporais e tecidos, o que acarreta na demora de resultados e possível contaminação no cultivo ou na amostra. A identificação correta é crucial para determinar o agente patogênico, a escolha e duração do antibiótico terapia. Neste sentido, objetivou-se desenvolver uma técnica de qPCR com SyberGreen para identificação e diferenciação de espécies de Candida. Para o desenvolvimento da qPCR foi construído um par de oligoiniciadores (primer) através de alinhamento das sequências de DNA de 5 espécies de Candida (C. albicans, C. glabrata, C. parapsilosis, C. tropicalis e C. krusei) usando a plataforma Blast. Os amplicons teóricos esperados foram de 223pb (C. albicans), 304pb (C. glabrata), 196pb (C. parapsilosis), 216pb (C. tropicalis) e 233pb (C. krusei).  Foi realizada uma curva de primers para teste de sua concentração com 0,2µM, 0,4µM e 0,6µM de primer para cada uma das 5 espécies de Candida. Após, foi feita qPCR com 67 amostras de extração de DNA de secreção vaginal, destas 33 amostras eram positivas para crescimento de leveduras e 34 eram negativas. Junto com a análise das amostras de secreção vaginal, foi testada a especificidade dos primers, adicionando DNA bacteriano (Staphylococcus) e DNA humano. Todas estas análises foram confirmadas através de eletroforese em gel de agarose 2%. A melhor concentração verificada na curva de qPCR e confirmada em gel de agarose para a reação foi de 0,2µM. Em relação às análises das amostras de secreção vaginal, do total de 34 amostras negativas para levedura, 58,8% (20) não apresentaram amplificação e 41,2% (14) tiverem algum tipo de amplificação mostrando ser uma possível contaminação. Destas amostras, 50% (7) tinham mais de um padrão de amplificação, 21,4% (3) das amplificações não foram identificáveis e 28,6% (4) possibilitaram identificação, sendo 2 de C. tropicalis, 1 de C. albicans e 1 de C. parapsilosis. Dentre as 33 amostras positivas para leveduras 30 (90,9%) foram identificadas como Candida. Destas, 18 foram identificadas em nível de espécie, a saber 44,5% (8) de C. albicans, 27,8% (5) de C. tropicalis, 16,7% (3) de C. glabrata, 5,5% (1) de C. parapsilosis e 5,5% (1) de C. krusei. As 12 amostras restantes apresentaram amplificação para Candida. Em 10 delas, mais de uma espécie pode ser identificada e, em duas, o resultado era inconclusivo quanto às espécies presentes. Vale ressaltar que, as amostras de Staphylococcus e de DNA humano adicionados juntos na reação de qPCR não foram amplificados, mostrando especificidade dos primers. Os primers construídos permitiram amplificação e diferenciação das 5 espécies de Candida, porém os resultados precisam ser confirmados por eletroforese em gel de agarose.  Isso se deve ao fato da curva de dissociação para cada amplicon das diferentes espécies apresentarem valores de Tm muito próximos. Nesse trabalho, foi possível mostrar que um único par de primers pode ser utilizado para, primeiramente, gerar um resultado positivo do gênero Candida pela qPCR e que quando seguido da análise eletroforética em gel de agarose 2% permite a diferenciação de pelo menos 5 espécies de Candida.