ADAPTAÇÕES DE TÉCNICA IN HOUSE DE EXTRAÇÃO DE DNA DE CANDIDA PARA UTILIZAÇÃO EM QPCR

Resumo

Candida sp. é uma levedura dimórfica que coloniza a pele, mucosa gastrointestinal e trato urinário como um agente comensal. Estudos revelam que as fungemias ocasionadas por leveduras do gênero Candida tem se tornado frequentes na prática médica, devido à sua habilidade de colonização, oportunismo e desafios terapêuticos atribuídos ao difícil diagnóstico e tratamento. O difícil diagnóstico ocorre pelo fato de que as técnicas convencionais de cultivo de fluidos corporais e tecidos tem uma série de limitações como a demora na obtenção dos resultados, a contaminação natural da amostra e do cultivo, além da necessidade de pessoal capacitado para a identificação. Uma técnica in house de extração de DNA, que permitisse a identificação e a quantificação de Candida por qPCR, seria importante para o diagnóstico, pois diferenciaria entre Candida de ocorrência natural da amostra dos estados de candidíase. O objetivo deste trabalho foi utilizar uma técnica in house de extração de DNA de Candida, identificar e quantificar o DNA através de qPCR. Foi cultivado em ágar Sabouraud, três espécies de Candida, C. albicans, C. parapsilosis e C. tropicalis. Após o crescimento, foram feitas diluições em salina de 1:1 e realizada contagem na Câmara de Neubauer, após ajustou-se uma solução com concentração de 50.000.000 de células por mL. A extração de DNA foi realizada através do protocolo simplificado de fungos leveduriformes, adaptado de Tavares et al. 2004. Foram testadas 3 modificações, um protocolo com maceração através de nitrogênio líquido e liticase, um segundo somente com liticase e o última com uma etapa de fervura. Em cada uma destas modificações foi testada a utilização de colunas na etapa final do protocolo. Os resultados das modificações foram confirmados por eletroforese em gel de agarose 0,8% e espectrofotometria. Ainda, foi substituído o NaCl 5M, por acetato de amônio 7,8M na etapa posterior a utilização do clorofórmio: álcool isoamílico (24:1). Para confirmar a qualidade do DNA extraído, as amostras foram submetidas à qPCR. Seguindo o protocolo original não se obteve boa qualidade da extração, com média da relação 260/280 nm de 0,99, sendo o ideal entre 1,8 a 2. Nas modificações, o protocolo com fervura apresentou relação mais próxima do ideal, porém não obteve bom rendimento de DNA, sendo o protocolo com nitrogênio líquido o melhor, com rendimento de 14,2 ng/µl de DNA. Estes resultados foram confirmados através de eletroforese em gel de agarose 0,8%. Os testes com colunas não foram satisfatórios, pois muito DNA ficava retido na mesma. A substituição do NaCl por acetato de amônio, melhorou a qualidade da extração elevando a média da relação 260/280nm para 1,7, o que possibilitou a utilização destas amostras na qPCR. Na reação de qPCR, houve amplificação das 3 espécies de Candida confirmadas em gel de agarose. A qPCR foi sensível para detectar até cerca de 6.000 células/mL. Também foi testada a especificidade da reação, incluindo no teste DNA humano e bacteriano que não apresentaram amplificação. Conclui-se que as modificações no protocolo original, como maceração da amostra por nitrogênio líquido e substituição do NaCl por acetato de amônio permitiu a utilização destas extrações para qPCR.