PADRONIZAÇÃO DE UMA TÉCNICA MOLECULAR PARA RÁPIDA IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS GRAM POSITIVAS E NEGATIVAS

Resumo

As Infecções Relacionadas a Assistência à Saúde (IRAS) são consideradas um problema de saúde pública, que vem acometendo pacientes internados em unidades hospitalares. Estas infecções são causadas por fungos, vírus, mas principalmente bactérias. Com o uso indiscriminado da terapia antimicrobiana, a resistência dos microrganismos frente aos antibióticos já conhecidos vem aumentando, gerando grande desafio para a comissão de controle de infecções hospitalares. Esta resistência é uma capacidade natural das bactérias de se adaptar ao meio em que vivem, então quando expostas ao uso inadequado de antibióticos estes agentes fazem aumentar significativamente a pressão seletiva. Diante disso, esses microrganismos acabam facilitando o desenvolvimento deste mecanismo de resistência. Estes patógenos oportunistas dividem-se em Gram positivos (Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermides) e Gram negativos (Escherichia coli, Pseudomonas aeroginosa). O início precoce da terapia antimicrobiana é fundamental quando se tem diagnóstico de infecção. A fim de reduzir o tempo de diagnóstico, a técnica de Reação da Cadeia de Polimerase (PCR) em tempo real é muito promissora a fim de diagnosticar infecções bacterianas, uma vez que é uma técnica rápida e de alta sensibilidade.  Padronizar uma PCR em tempo real para identificação de bactérias Gram positivas e negativas.  Realizou-se um estudo experimental utilizando amostras de bactéria Gram positivas e Gram negativas padrões da American Type Culture Collection (ATCC). As cepas utilizadas para microrganismos Gram positivo foi Staphylococcus aureus (ATCC 29213) e para Gram negativos foram Escherichia coli (ATCC 25922) e Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853). Estas foram semeadas em Ágar Muller Hinton e incubadas à 37ºC por 24 horas. Após, foi realizada a extração de DNA microbiano pela técnica de lavagem/lise alcalina, descrito por Millar (2000), com adaptações no número de rotações por minuto de cada centrifugação e lavagem única com Tris-HCl. Para a reação de PCR Universal TaqMan 16S rDNA bacteriano foram utilizados primers NT-341Fw (GACTCCTACGGGAGGC) e 16S-522Rv (GCGGCTGCTGGCAC) e probes específicas para bactérias Gram positivas (FAM- CTGA(T/C)(G/C)(G/C)AGCAACGCCGCG-MGB) e Gram negativas (VIC- CCTGA(T/C)(G/C)CAGC(A/C)ATGCCGCG–MGB). A solução mix da PCR obedeceram às seguintes concentrações: 10µL de TaqMan Universal PCR Master Mix, 0,5 µL de cada primer 0,4 µL da probe Gram positiva, 0,6 µL da probe Gram negativa, 2 µL de amostra (10-15 ng/µL) e água estéril livre de DNAse /RNAse, para um volume final de 20µL. As condições de temperatura utilizadas foram 50ºC por 2 minutos; 95ºC por 10 minutos; seguidos de 40 ciclos de 95ºC por 15 segundos e 60ºC por 1 minuto.  A reação de qPCR para detecção da bactéria Gram positiva Staphylococcus aureus obteve Ct de 25,15 e 25,41. A reação de qPCR para detecção da bactéria Gram negativa Escherichia coli obteve Ct de 18,95 e 19,02. A reação de qPCR para detecção da bactéria Gram negativa Pseudomonas aeruginosa obteve Ct de 31,47 e 31,39. A técnica de qPCR apresentou resultados positivos, podendo se identificar as bactérias Gram positivos das bactérias Gram negativos nas amostras padrão ATCC. Além disso, esta técnica é muito promissora para a rápida identificação de bactérias, promovendo o seu diagnóstico precoce, auxiliando na escolha de antibioticoterapia adequada e melhorando as chances de sobrevida do paciente.